Specyficzna formuła mikroskładników odżywczych hamuje dwa kluczowe mechanizmy infekcji koronawirusem (SARS-CoV-2): wiązanie wirusa z receptorem ACE2 i jego ekspresję komórkową
A. Goc, Ph.D., W. Sumera, M.Sc., Vadim Ivanov, M.D., Ph.D., Aleksandra Niedzwiecki, Ph.D., Matthias Rath, M.D.
Dr. Rath Research Institute, San Jose, CA
PODSUMOWANIE
Wprowadzenie
Pandemia koronawirusa stanowi bezprecedensowe wyzwanie dla zdrowia ludzkiego, a także dla gospodarki na całym świecie. Poszukiwanie szczepionek i innych sposobów powstrzymania tej pandemii koncentrowało się dotychczas na badaniu cząsteczek syntetycznych, których stosowanie – logicznie rzecz biorąc – prawie zawsze wiąże się z mniej lub bardziej poważnymi skutkami ubocznymi.
Wyniki
Specyficzna formuła mikroskładników odżywczych może prawie całkowicie zablokować interakcję pomiędzy miejscem wiązania koronaawirusa a jego punktem zaczepienia w komórce, receptorem ACE2. Co więcej, przebadana formuła mikroelementów była w stanie znacząco (o ponad 90%) zmniejszyć ekspresję receptora ACE2 na powierzchni ludzkich komórek nabłonka oddechowego w pęcherzykach płucnych.
Podsumowanie
Diese Studie bildet die Grundlage für wirksame und sichere Strategien im Bereich der öffentlichen Gesundheit, die eine optimale Zufuhr von Mikronährstoffen zur Grundlage haben. Sie ermöglicht es Menschen weltweit, sich aktiv an der Prävention von Coronavirus-Infektionen zu beteiligen. Damit erweitert die hier vorgestellte Mikronährstoff-Strategie die bisherigen Präventions-Maßnahmen, wie das Tragen von Masken, Social Distancing und anderen Schritte, erheblich.
WPROWADZENIE
Szybkie rozprzestrzenianie się obecnej pandemii koronawirusa (COVID-19) zagraża zdrowiu na świecie, osłabia gospodarkę i stanowi wyzwanie dla dobrobytu przyszłych pokoleń (Chakraborty 2020). W pierwszej połowie 2020 r. pandemia COVID-19 dotknęła bezpośrednio ponad 16 milionów osób i spowodowała ponad 660 000 zgonów na całym świecie (https://covid19.who.int/).
W wyniku sekwencjonowania całego genomu wirusa z próbek pobranych od chorych pacjentów (Zhu 2020) zidentyfikowano nowy zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej koronawirus 2 (SARS-CoV-2), a chorobę wywołaną przez tego wirusa nazwano choroba koronawirusową 2019 (COVID-19).
Ważnym krokiem w kierunku powstrzymania rozprzestrzeniania się tej pandemii było zidentyfikowanie drogi przez którą SARS-CoV-2 infekuje komórki ludzkiego organizmu. Koronawirus wiąże się z określonymi receptorami na powierzchni komórek. Następnie przedostaje się do wnętrza komórek i przenoszony przez pęcherzyki transportowe (endosomy), dociera ostatecznie do rdzenia komórkowego (jądra), gdzie jego materiał genetyczny zostaje włączony do DNA komórek ludzkiego organizmu (Li 2016).
Szczególne znaczenie ma pierwszy etap zakażenia, czyli wiązanie wirusa z receptorem na powierzchni komórki (grafika 1). Jeśli chodzi o koronawirusa, to ten mechanizm wiążący obejmuje specyficzne białka SPIKE, które są umiejscowione na powierzchni wirusa. Zawierają one domenę wiążącą receptory (RBD), która w sposób szczególny rozpoznaje „miejsce dokowania” – specyficzny receptor na powierzchni komórek organizmu. Ten receptor, zwany enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), jest białkiem zakotwiczonym w błonie komórkowej w wielu komórkach całego organizmu ludzkiego, z silną ekspresją w mięśniu sercowym, układzie naczyniowym i pokarmowym, nerkach, jak również komórkach nabłonka oddechowego w pęcherzykach płucnych typu II. (Li 2003, Hofmann 2005).
Ten mechanizm wiążący ma znaczący wpływ na zdolność wirusa do infekcji komórek organizmu i wywoływania choroby koronawirusowej (COVID-19). W związku z tym, ten mechanizm wiążący odgrywa również niezwykle ważną rolę przy opracowywaniu szczepionek i przy innych tego typu podejściach terapeutycznych. (Du 2009, Du 2017).
Podczas gdy ciągle trwają poszukiwania leków i szczepionek opartych na tym mechanizmie, to istnieje znacznie bardziej bezpośredni – a przede wszystkim bezpieczniejszy – sposób zapobiegania tej fatalnej w skutkach interakcji koronawirusa z receptorem ACE2: Mianowicie jest nim tłumienie ekspresji receptorów ACE2 w komórkach ludzkiego organizmu, dzięki czemu koronawirus nie może się w komórkach „zakotwiczyć”.
W przeprowadzonym niedawno pionierskim badaniu dowiedliśmy, że specyficzna formuła mikroskładników odżywczych zawierająca witaminę C, wybrane minerały, aminokwasy i wyciągi roślinne była skuteczna w znacznym obniżeniu ekspresji ACE2 w kluczowych typach komórek docelowych wirusa: w ludzkich komórkach płuc (komórki nabłonka płuc) oraz w komórkach naczyniowych (komórki śródbłonka). Właśnie te mikroelementy były szczególnie skuteczne w obniżaniu ekspresji receptora ACE2 przy stanach zapalnych, które są zawsze związane z koronawirusem i innymi infekcjami (Ivanov 2020).
Bardzo dobre wyniki tego badania sprawiły, że postawiliśmy sobie kolejne pytanie. Czy mikroelementy są również w stanie wpływać na inny mechanizm istotny dla infekcji koronawirusowych, a mianowicie na wiązanie wirusa z receptorem ACE2? Próbując odpowiedzieć na to pytanie dążyliśmy do zablokowania przedostawania się wirusa do ludzkich komórek – ten sam mechanizm jest również promowany przez prawie wszystkie obecne podejścia oparte na szczepieniach.
Gdyby wyniki naszego badania okazały się pozytywne, to ludzkość miałaby dostęp do nowego, naturalnego i bezpiecznego podejścia, które umożliwiłoby skuteczne opanowanie obecnej pandemii.
Dlatego też, w przedstawianym badaniu przetestowaliśmy skuteczność kolejnej formuły mikroelementów (zawierającej polifenole i inne składniki roślinne) w obu kluczowych aspektach infekcyjności SARS-CoV-2: Zbadaliśmy mianowicie blokowanie ekspresji receptora ACE2 i jednocześnie blokowanie wiązania specyficznego białka SPIKE SARS-CoV-2 z receptorem ACE2 na powierzchni ludzkich komórek.
Fig 1:
A. Koronawirusy zarażają komórki ludzkiego organizmu poprzez receptor ACE2.
B. Zasada metody badawczej stosowanej w tym badaniu do pomiaru interakcji między białkiem wiążącym receptory (RBD) koronawirusa (SARS-CoV-2) a receptorem ACE2 na powierzchni komórek.
WYNIKI
Skuteczność specyficznej formuły mikroskładników odżywczych na ekspresję ACE2 w ludzkich komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.
Wykres 1 przedstawia wpływ różnych stężeń specyficznej formuły różnych aktywnych składników i ekstraktów roślinnych na ekspresję receptorów ACE2 w ludzkich komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.
Wykres 2 przedstawia wpływ badanej formuły mikroskładników odżywczych na ekspresję ACE2 w ludzkich komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych. Zmiany w ekspresji ACE2 są przedstawione jako % kontroli.
Wyniki wskazują na zależny od stężenia spadek ekspresji receptora komórkowego ACE2 oceniany przez specyficzne wiązanie przeciwciał. Przy najwyższym stężeniu mikroskładników wynoszącym 320 ug/mL ekspresja komórkowych receptorów ACE2 zmniejszyła się o 92%. Wynik ten wskazuje na to, że w obecności zastosowanych mikroskładników odżywczych wiązanie wirusowe z receptorami komórkowymi może być znacznie zredukowane.
Wpływ specyficznej formuły mikroelementów na wiązanie RBD z receptorem ACE2
Wiązanie sekwencji RBD białka SPIKE SARS-CoV-2 z receptorem komórkowym jest niezbędnym krokiem uzyskania dostępu do komórek docelowych i jest warunkiem wstępnym zakażenia. Dlatego też badaliśmy wpływ specyficznej mieszanki aktywnych składników roślinnych na blokowanie interakcji tej sekwencji wiążącej receptora białka SPIKE SARS-CoV-2 z ludzkim receptorem ACE2. W naszym badaniu zastosowaliśmy najnowocześniejszy test przesiewowy o wysokiej czułości, który może wykryć inhibitory blokujące interakcję domeny wiążącej receptora (RBD) wirusowego białka SPIKE z receptorem ACE2.
Wykres 3:
Blokowanie wiązania białka SPIKE SARS-CoV-2 (RDB) z receptorem ACE2 przez specyficzną formułę mikroskładników odżywczych w % kontroli. „Kontrola blokowania” = 100% zahamowanie wiązania.
Wykres 3 pokazuje, że testowana formuła naturalnych ekstraktów roślinnych była w stanie zablokować przyłączanie domeny RBD białka SPIKE SARS-CoV-2 do receptora ACE2 komórki. Ten efekt blokujący był zależny od stężenia i przy stężeniu mieszanki 100 µg / ml powodował 97% blokowanie wiązania. Jego silną skuteczność w zapobieganiu wiązaniu wirusów obserwowano już przy 40-krotnie niższym stężeniu, tj. 2,5 µg / ml, co spowodowało około 20% zablokowanie wiązania.
DYSKUSJA
Znaczenie naszych wyników
Wyniki przedstawione w niniejszym opracowaniu potwierdzają, że mikroskładniki odżywcze mogą silnie hamować ważne mechanizmy komórkowe związane z zakażeniem koronawirusem. Wyniki te stają się dostępne w krytycznym momencie, kiedy światowa społeczność naukowa i medyczna rozpaczliwie poszukuje skutecznych rozwiązań pandemii COVID-19. Wykorzystując metody naukowe i najnowocześniejsze techniki stosowane w badaniach nad koronawirusami, udało nam się wykazać, że mikroelementy mogą hamować interakcję miejsca wiązania wirusa (RBD białka SPIKE SARS-CoV-2) i specyficznego receptora komórkowego (ACE2) o 97%. Oznacza to, że mikroelementy mogłyby prawie całkowicie zapobiec ryzyku infekcji wirusowej. Ponadto, ten sam skład mikroskładników odżywczych hamował ekspresję receptorów ACE2 na ludzkich komórkach nabłonka oddechowego w pęcherzykach płucnych nawet o 92%.
Wcześniej informowaliśmy również, że inna formuła mikroelementów składająca się m. in. z witaminy C, aminokwasów, substancji roślinnych i minerałów może znacząco zmniejszyć ekspresję receptorów ACE2 na dwóch typach komórek, które najczęściej atakuje koronaawirus: komórki nabłonka oddechowego w pęcherzykach płucnych oraz komórki śródbłonka układu naczyniowego. (Ivanov 2020).
Innym ważnym odkryciem tego badania było stwierdzenie, że hamowanie ekspresji receptorów ACE2 było jeszcze bardziej wyraźne w warunkach prozapalnych, które towarzyszą każdej infekcji wirusowej. Oznaczałoby to, że skuteczność działania mikroskładników odżywczych byłaby jeszcze większa w warunkach klinicznych i w zaawansowanych stadiach COVID-19, charakteryzujących się stanem zapalnym i tzw. burzą cytokinową.
Obecne badania wskazują, że określone receptury biologicznie aktywnych związków pochodzenia roślinnego mogą być skuteczne w kontrolowaniu dwóch krytycznych mechanizmów zaangażowanych w infekcyjność koronawirusa.
W świetle naszych ustaleń szczególnie rozczarowujące jest to, że dotychczas w wysiłkach naukowych w dużej mierze pominięto obszerny zbiór dowodów naukowych i klinicznych, które potwierdzają skuteczność mikroelementów w wielu aspektach infekcji wirusowych (Jariwalla 2007, Jariwalla 2010, Deryabin 2008, Barbour 2007).
Dowody na to, że związki naturalne, takie jak mikroskładniki odżywcze, mogą być odpowiedzią na koronawirusa i inne pandemie, powinny zainspirować środowiska naukowe i medyczne do podjęcia globalnych wysiłków na rzecz poszerzenia ogólnej wiedzy na temat korzyści terapeutycznych wynikających ze stosowania mikroelementów i innych związków naturalnych w profilaktyce chorób zakaźnych.
Skutki tych ustaleń dla polityki zdrowia publicznego
Rozmiary obecnej pandemii oraz wymiar jej kosztów ludzkich i ekonomicznych sprawiają, że nasza dokumentacja dotycząca szczególnego znaczenia mikroskładników odżywczych w kontrolowaniu tej pandemii jest przekonywującym podejściem do zdrowia publicznego.
Jest to szczególnie ważne, ponieważ wszystkie inne opracowywane obecnie środki są albo związane z poważnymi skutkami ubocznymi, albo stanowią nowatorskie i niesprawdzone strategie. Ostrożne reakcje społeczności międzynarodowej na pierwsze zarejestrowane szczepionki, które są oparte na genach wirusów, świadczą o świadomości potencjalnych zagrożeń związanych z wdrażaniem takich technologii wśród całej populacji.
W oparciu o wyniki naszych badań, naukowo udowodnione podejście oparte na stosowaniu mikroelementów staje się dostępne jako skuteczna – i bezpieczna – strategia zdrowia publicznego mająca na celu zwalczanie obecnej pandemii. Przy wskaźniku blokowania wynoszącym prawie 100%, mikroskładniki odżywcze rywalizują ze skutecznością każdej szczepionki – jednak bez żadnych nieobliczalnych skutków ubocznych. Ponadto podejście to poszerza potencjalne korzyści dla zdrowia poprzez zajęcie się innymi krytycznymi mechanizmami związanymi z zakażeniami koronawirusowymi. Mechanizmy te obejmują znaczne zmniejszenie dostępności punktów zaczepienia dla wirusów (receptorów ACE2) na powierzchni komórek ludzkich oraz istotne wsparcie dla funkcjonowania układu odpornościowego.
A więc ta strategia oparta na mikroelementach wykracza i przewyższa noszenie maseczek, dystans społeczny i inne stosowane obecnie działania.
REFERENCJE
- Chakraborty I, Maity COVID-19 outbreak: Migration, effects on society, global environment and prevention. Sci Total Environ. 2020; 728: 138882. https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.scitotenv.2020.138882
- WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/. Updated August 13, Accessed August 14, 2020.
- Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382(8): 727-733. doi: 1056/NEJMoa2001017
- Li Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu. Rev. Virol. 2016; 3(1): 237-261. doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301
- Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin- converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426(6965): 450–454. https://doi.org/10.1038/nature02145
- Hofmann H, Pyrc K, van der Hoek L, Geier M, Berkhout B, Pohlmann S. Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(22):7988– 7993. https://doi.org/10.1073/pnas.0409465102
- Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang S. The Spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7, 226–236. https://doi.org/10.1038/nrmicro2090
- Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang. MERS-CoV Spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21(2): 131-143. doi:10.1080/14728222.2017.1271415
- Ivanov V, Ivanova S, Niedzwiecki A, Rath M. Effective and save global public health strategy to fight the COVID-19 pandemic: Specific micronutrient combination inhibits Coronavirus cell-entry receptor (ACE2) expression. J Cell Med & Nat. Health, 2020.
- Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
- Jariwalla R, Gangapurkar B, Pandit A, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Micronutrient Cooperation in Suppression of HIV Production in Chronically and Latently Infected Cells. Mol Med 2010; 3(3): 377-85. doi: 10.3892/mmr_00000268.
- Deryabin PG, Lvov DK, Botikov AG, et al. Effects of a nutrient mixture on infectious properties of the highly pathogenic strain of avian influenza virus A/H5N1. Biofactors. 2008; 33(2): 85-97. doi: 10.1002/biof.5520330201.
- Barbour EK, Rayya EG, Shaib H, et al. Alleviation of histopathological effects of avian influenza virus by a specific nutrient synergy. International J Appl Res Vet Med. 2007; 5(1): 9-16.
MATERIAŁY I METODY
Kultury komórkowe
Ludzkie komórki nabłonkowe dróg oddechowych (zwane dalej z angielskiego SAEC; firmy ATCC) były hodowane na podłożu wzrostowym (ATCC) w plastikowych kolbach w temperaturze 37°C i 5% stężeniu CO2. W doświadczeniu z SAEC, zastosowano pasaż komorek 5-7 oraz 96-dołkowe pokryte kolagenem płytki plastikowe (Corning), w których w 100 μL pożywki hodowano komórki do osiągnięcia ich spójnej warstwy przez 4-7 dni.
Skład formuły
Zastosowana w naszych eksperymentach formuła mikroskładników odżywczych została opracowana w Instytucie Badawczym dr Ratha (San Jose, CA). Skład zastosowanej formuły testowej: kwercetyna – 400 mg, ekstrakt z roślin krzyżowych – 400 mg, ekstrakt z korzenia kurkumy – 300 mg, ekstrakt z zielonej herbaty (80% polifenoli) – 300 mg i resweratrol – 50 mg.
Suplementacja komórkowa
Mieszanina mikroelementów została rozpuszczona w 0,1N HCl zgodnie z protokołem US Pharmacopeia (USP 2040) i oznaczona jako roztwór podstawowy. W doświadczeniach z ekspresją ACE2, komórki SAEC uzupełniano wskazanymi dawkami preparatu w podłożu wzrostu komórek przy 100 μl/basenik przez 3-7 dni. Zastosowane stężenia mikroskładników odżywczych wyrażono w μg/ml.
Badanie ACE2 ELISA
Dołki z płytkami hodowlanymi zostały dwukrotnie przepłukane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrwalone 3% roztworem formaldehydu/0,5% Triton X100/PBS przez 1h w temperaturze 4°C, a następnie czterokrotnie przepłukane PBS. Następnie dodano 200 μL 1% albuminy surowicy bydlęcej BSA (Sigma) w PBS. Płyta była następnie inkubowana przez noc w temperaturze 4°C. Poliklonalne królicze przeciwciała antyACE-2 (Sigma) dodano do 100 μL 1%BSA/PBS i inkubowano 1.5 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Po trzech cyklach przemycia z 0,1% BSA/PBS, do dołków dodano 100 μL króliczych przeciwciał anty-IgG sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP, Sigma) na 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Po trzech cyklach płukania 0,1%BSA/PBS pozostałą aktywność HRP oznaczono poprzez inkubację 100 μL roztworu substratu TMB (Sigma) przez 20 min w RT, po czym dodano 50 μL 1N H2SO4 i dokonano pomiaru gęstości optycznej przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Molecular Device). Wyniki są wyrażone jako procent kontroli bez dodatków (wartość średnia +/- SD, n=6). Średnia wartość kontroli nieswoistej (dołki inkubowane bez przeciwciała antyACE2) (n=6) została odjęta od wszystkich wartości próbek.
Blokowanie RBD (domena wiążąca receptory)
Badanie to zostało przeprowadzone przy użyciu zestawu do testu neutralizacji wirusa zastępczego GenScript SARS-CoV-2, który może wykryć albo przeciwciało, albo inhibitory blokujące interakcję między domeną wiążącą receptor (RBD) białka SPIKE wirusa a receptorem powierzchniowym komórki ACE2.
Wszystkie badane próbki o wskazanych stężeniach oraz kontrole pozytywne i negatywne (dostarczone przez producenta) zostały rozcieńczone buforem do rozcieńczania próbek o stosunku objętości 1:9. W oddzielnych probówkach koniugowana RBD z HRP była również rozcieńczana buforem rozcieńczającym HRP o stosunku objętościowym 1:99.
Reakcja wiązania / neutralizacji została przeprowadzona zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczone kontrole dodatnie i ujemne oraz badane próbki o wskazanych stężeniach zostały krótko wymieszane z rozcieńczonym roztworem HRP-RBD w stosunku objętościowym 1:1 i inkubowane w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie do odpowiednich dołków zawierających unieruchomiony receptor ACE2 dodano po 100 µl każdej z mieszanin kontroli dodatniej, kontroli ujemnej i mieszanin badanych próbek i inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie płytki zostały czterokrotnie przepłukane 260 µl/dołek 1 x roztwór do Płukania i do każdego basenika dodano roztwór TMB (100 µl/dołek). Płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez okres do 5 minut. Następnie dodano 50 µl/dołek roztworu podstawowego w celu stłumienia reakcji, a absorbancja została zmierzona natychmiast w czytniku płytek przy długości fali 450 nm. Eksperyment został przeprowadzony trzy razy w dwóch powtórzeniach. Wartości te są podane w % kontroli.